Auf dem Weg zur unbeaufsichtigten und systematischen Segmentierung biologischer Organismen
Bildgebungsanwendungen für die Hochdurchsatzmikroskopie stellen ein wichtiges Forschungsgebiet dar, das eines Tages Werkzeuge für die automatische Quantifizierung lebender Organismen auf Multiskalensystemebene (molekular-, Zell- und Gewebeebene) bereitstellen wird. Im Rahmen des WingX-Projekts wurde ein SystemsX.ch initiative, die wir entwickelt haben
methoden und Berechnungswerkzeuge zur unbeaufsichtigten Segmentierung der
Drosophila
Flügel
.
Unser erster Beitrag ist die Entwicklung eines neuartigen Bildverarbeitungsalgorithmus zur
automatisch auf ein Modell der morphologischen Struktur des sich entwickelnden schließen
Drosophila
Flügel
(auch genannt
flügeltasche
) aus konfokalen Fluoreszenzbildern. Neben der Bereitstellung wertvoller Informationen zur Morphologie des Flügels verwenden wir das parametrische Strukturmodell für
systematische räumliche Quantifizierung der Genexpression
. Um morphologische und Expressionsdatensätze zu vervollständigen, haben wir eine implementiert
unbeaufsichtigtes 3D-Zellkern-Nachweisverfahren
. Als Beispiel haben wir diese Methode angewendet, um die Anzahl der Kerne im Wildtyp zu zählen und
pentagon
mangelhafte Flügel, um die Auswirkung der Mutation auf die Wachstumsrate des Flügels zu untersuchen. Schließlich entwickelten wir eine Methode für
integration von morphologischen und Expressionsdatensätzen
von vielen Individuen gesammelt und dann eine generiert
zuverlässige und robuste quantitative Beschreibung
des interessierenden biologischen Systems.
Neu!
Eine aktualisierte Version des Benutzerhandbuchs ist verfügbar
hier
.
Die erwachsenen Anhängsel von
Drosophila
solche Flügel, Beine, Antennen und Halfter (die Ausgleichsorgane der Fliege) leiten sich ab von
imaginäre Scheiben
(
Moratas, 2001
). Diese imaginären Scheiben bilden sich im Embryo als kleine Ansammlung von Zellen (
Martin
et al.
, 2009
). Während der Wachstumsphase bestehen die Imaginalscheiben hauptsächlich aus a
einlagiges Blatt aus säulenförmigen Zellen
, die an eine andere Zellschicht angrenzt, die peripodiale Membran genannt wird. Es gibt zwei diskrete Stadien, die die Scheiben während der Larvenentwicklung metamorphosieren. Während des Wachstums hängt die Musterung der Bandscheiben von sekretierten Molekülen ab, die als Morphogene bezeichnet werden. Beispiele für Morphogene sind Dekapentaplegie (Dpp) und Flügellose (Wg), die beide für die ordnungsgemäße Entwicklung der Flügel-Imaginalscheiben erforderlich sind (
Lorenz
et al.
, 1996
;
Affolter
et al.
, 2007
). Die Anzahl der Zellen nimmt in vier Tagen (während der Larvenperiode) um ungefähr das 1000-fache zu und erreicht fast 50'000 Zellen in einem Entwicklungsstadium, das als bezeichnet wird
spätes drittes Stadium
(
Martin
et al.
, 2009
).
Die unten dargestellte Flügelscheibe enthält einen Bereich, der als bezeichnet wird
flügeltasche
. Im erwachsenen Flügel entsteht aus dem Flügelbeutel der
flügelblatt
während der es umgebende Teil (Scharnier genannt) ein flexibles Glied bildet, das das Flügelblatt an der Körperwand der Fliege befestigt. Der Flügelbeutel ist durch die anterioren / posterioren (A / P) und dorsalen / ventralen (D / V) Kompartmentgrenzen in vier Kompartimente unterteilt (
García-Bellido
et al.
, 1973
). Die Beziehung zwischen diesen vier Fächern des Beutels und dem Erwachsenenflügel wird im beigefügten Video vorgestellt. Wir verwenden die Expression von Wingless (Wg), die mit Antikörpern nachgewiesen wurde, um die Kontur des Flügelbeutels und die D / V-Grenze zu visualisieren. In ähnlicher Weise kann die A / P-Grenze über die Expression von Patched (Ptc) identifiziert werden. Während der Eversion dreht sich der einzellige geschichtete Flügelbeutel um, um die
doppellagiger Flügel für Erwachsene
.
Unbeaufsichtigte Segmentierung der
Drosophila
flügeltasche
Das erste Ziel dieses Projekts war die Entwicklung einer unüberwachten Erkennungs- und Segmentierungsmethode für
quantifizierung der morphologischen Struktur des
Drosophila
flügeltasche
. Wir nehmen als Eingabestapel Fluoreszenzbilder (3D-Bilder), in denen die Struktur des Flügelbeutels sichtbar gemacht wird, indem die Expression von zwei Proteinen, die als Flügellos (Wg) und Patch (Ptc) bezeichnet werden, mit Fluoreszenzmarkern gefärbt wird. Anschließend wenden wir eine Reihe vollautomatischer Bildverarbeitungs-Erkennungsmodule an, um spezifische Merkmale des Beutels zu identifizieren. Durch Integration der Ausgabe der Detektionsmodule wird ein parametrisches Modell rekonstruiert, das die morphologische Struktur des Beutels (einschließlich seiner Ausrichtung im Bildraum) beschreibt.
Wir zeigen unten drei Flügelscheiben, die 80, 90 und 100 Stunden nach der Eiablage (AEL) abgebildet wurden. Das erste Feld zeigt die Projektion der maximalen Intensität eines Stapels konfokaler Bilder, in denen die Expression von Wg-Ptc mit Fluoreszenzmarkern gefärbt wurde. Das zweite Feld zeigt das von unserer Methode automatisch identifizierte parametrische Strukturmodell, das durch Verschieben der Kontrollpunkte '+' lokal bearbeitet werden kann. Schließlich berichtet das dritte Panel über das validierte Strukturmodell nach automatischer Orientierungsinferenz. Hier entspricht DA beispielsweise dem dorsal-anterioren Kompartiment.
Um dem Anwender die volle Kontrolle über den Segmentierungsprozess zu geben, kann die Quantifizierung der morphologischen Struktur des Flügelbeutels Schritt für Schritt durchgeführt werden. In diesem Modus kann der Ausgang jedes Erkennungsmoduls überwacht und bei Bedarf bearbeitet werden. Dieser Modus ist besonders nützlich, um zu verstehen, warum eine Reihe von Bildern nicht erfolgreich verarbeitet werden konnte. Der gleiche Modus ermöglicht es, nacheinander ein bestimmtes Erkennungsmodul mit unterschiedlichen Parameterwerten anzuwenden.
Unbeaufsichtigte Erkennung der
Drosophila
Embryo
Weil die
Drosophila
embryo ist ein weitgehend untersuchtes Systemmodell, wir haben auch eine Methode implementiert, die die automatische Erkennung und Segmentierung der Embryostruktur ermöglicht. Diese Methode verwendet einige der Bildverarbeitungs-Erkennungsmodule, die wir zuvor entwickelt haben, um die Struktur des zu identifizieren
Drosophila
flügeltasche.
Hier sind die Detektionsmodule: 1) Detektion der Kontur des Embryos (unter Verwendung aktiver Konturen), 2) Detektion der dorsal-ventralen und anterior-posterioren Achse, 3) automatische Inferenz der Embryoorientierung und 4) Möglichkeit, das abgeleitete Strukturmodell manuell zu bearbeiten. Nachfolgend zeigen wir zwei Beispiele für die Quantifizierung der Embryonenstruktur.
Heutzutage konzentrieren sich viele Studien auf eine räumliche Dimension, bevor sie die Komplexität ihrer Modelle erhöhen. Beispiele umfassen die Skalierung der Signalaktivität mit der Größe wachsender Gewebe (
Hamaratoglu
et al.
, 2011
) und das Reverse Engineering von Entwicklungsgenregulationsnetzwerken (
Jäger
et al.
, 2011
;
Perkins
et al.
, 2006
). Um die Gen- und Proteinexpression in einer räumlichen Dimension zu messen, leiten wir die Strukturmodelle der einzelnen Systeme ab, die zuvor abgeleitet wurden, um systematische Trajektorien zu generieren. Die erhaltenen Datensätze werden aufgerufen
expressionsprofile
.
Es sind nur zwei Parameter erforderlich, um eine Trajektorie zu erzeugen: die
bezugsgrenze
(A/P oder D/V) und a
übersetzungsoffset
. Der letzte Fall unten zeigt die Trajektorie, die erhalten wird, wenn die D / V-Grenze entlang von 45% der Trajektorie der CD-Achse verschoben wird (C ist das Zentrum des Modells, D ist der Schnittpunkt der A / P-Grenze mit dem dorsalen Teil der äußeren Grenze des Modells). Beachten Sie, dass das Platzieren des Offset-Reglers auf -45% die D / V-Grenze in Richtung des ventralen Teils der Struktur verschoben hätte.
Wir wollten jedoch die Quantifizierung der Gen- und Proteinexpression überall innerhalb des abgeleiteten Strukturmodells unterstützen. Wenn die Generierung von Expressionsprofilen relativ offensichtlich ist, bestand die Hauptherausforderung darin, von einer 1D- zu einer 2D-Diskretisierung des Systems überzugehen. Um dies zu überwinden, haben wir eine definiert
koordinatensystem abgeleitet aus dem morphologischen Strukturmodell, das zuvor durch unsere unüberwachte Segmentierungsmethode identifiziert wurde
. Gitterdarstellungen dieses Koordinatensystems sind unten für gezeigt
Drosophila
flügel, die zu verschiedenen Zeiten während der Entwicklung abgebildet wurden. Hier haben wir diese Darstellung verwendet, um eine quantitative Beschreibung der Wirkung der zu erhalten
pentagon
mutation auf der Morphologie des sich entwickelnden Flügels.
Der Vorteil dieses Koordinatensystems besteht darin, dass es eine Möglichkeit bietet, Expressionsniveaus in einem zu messen
systematischer Weg in vielen Einzelsystemen
. Hier haben wir diese Methode verwendet, um die relative Expression von fünf Genprodukten zu verschiedenen Zeitschritten während der Flügelentwicklung zu messen. Ausdruck wird an den Schnittpunkten der Gitter gemessen, deren Auflösung frei eingestellt werden kann, bevor für jedes einzelne System eine Zwischendarstellung erzeugt wird, die als bezeichnet wird
kreisförmige Ausdruckskarte
.
Dank dieser Darstellung,
räumliche Genexpressionsdaten können integriert werden
trotz der Tatsache, dass sie aus einzelnen Systemen mit intrinsisch unterschiedlichen Formen gesammelt wurden. Die unten gezeigten Expressionskarten von Pmad-GFP, Pmad-AB, Brk-AB, Sal-AB und Omb-AB entsprechen jeweils einer durchschnittlichen Expressionskarte, die aus fünf bis zehn Flügeln berechnet wurde.
Neben der Bereitstellung eines Werkzeugs, das direkt zur Untersuchung der Skalierung von Aktivitätsgradienten in wachsenden Geweben verwendet werden kann, kann diese Darstellung verwendet werden, um
expression Maps visualisieren und vergleichen
erhalten unter verschiedenen Versuchsbedingungen. Beispiele hierfür sind Systeme, die zu verschiedenen Zeitpunkten während der Entwicklung abgebildet wurden, oder Systeme mit unterschiedlichen genetischen Hintergründen.
Zuverlässige und robuste quantitative Beschreibung
Ein weiterer Beitrag dieses Projekts ist die
integration von phänotypischen und Expressionsdaten
gesammelt aus vielen Einzelsystemen. Ziel ist es, eine zu erhalten
einzelnes und zuverlässiges Mehrskalenmodell
aus vielen Systemen, die unter den gleichen experimentellen Bedingungen erzeugt wurden. Wir gehen davon aus, dass solche quantitativen Beschreibungen in der wissenschaftlichen Forschung sehr nützlich sein werden, insbesondere für das Reverse Engineering prädiktiver Multiskalenmodelle biologischer Organismen.
Wir stellen die folgende Schnittstelle zur Verfügung, um einfach
visualisieren Sie quantitative Beschreibungen der Entwicklung
Drosophila
Flügel
die wir mit der oben beschriebenen systematischen Methode generiert haben. Die gezeigten Daten können verwendet werden, um Einblicke in die Expressionsdomänen verschiedener Genprodukte in Wildtyp und
pentagon
mangelhafte Flügel in verschiedenen Zeitschritten während der Entwicklung. Die Genprodukte sind jeweils den roten, grünen und blauen Bildkanälen zugeordnet, um RGB-Bilder zu erzeugen.
Für jede Versuchsbedingung wurde die Form des Flügels aus den einzelnen Strukturmodellen von fünfzehn bis dreißig Flügeln generiert
. Die gestrichelte Linie stellt die
Standardabweichung
der Strukturmodelle. Darüber hinaus entspricht die Expressionsdomäne jedes Genprodukts einer mittleren Expressionskarte, die aus fünf bis zehn einzelnen Flügeln berechnet wurde. Beachten Sie, dass nach der Quantifizierung der einzelnen Systeme die Generierung phänotypischer und expressionsintegrierter Modelle automatisch mit unserer Software erfolgt.
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Automatische 3D-Zellkernerkennung
Um Informationen auf zellulärer Ebene bereitzustellen, haben wir eine entwickelt
vollautomatischer Algorithmus zur 3D-Zellkerndetektion und -segmentierung
in Stapeln konfokaler Bilder, in denen Kerne mit fluoreszierenden fluoreszierenden Proteinen markiert sind.
In unserem Experiment verwendeten wir TO-PRO-3 (einen Fluoreszenzfarbstoff), um die Zellkerne in der Flügel-Imaginalscheibe sichtbar zu machen. Um die Kerne, die in der Flügeltasche enthalten sind, genau zu detektieren, wird die
das zuvor abgeleitete Strukturmodell wird verwendet, um ein interessierendes Volumen zu definieren
innerhalb des Bereichs des Bildstapels. Denn der Flügelbeutel ist ein relativ flaches einzelliges Schichtgewebe vor
flügel-Eversion
wird seine Struktur durch ein 2D-Modell beschrieben. Hier wird dieses Modell entlang der Z-Achse des Bildraums projiziert, um das interessierende Volumen zu definieren.
Das folgende Video zeigt die Ausgabe des unbeaufsichtigten Algorithmus, bei dem Zellkerne mit verschiedenen Farben markiert sind. Die einzelnen Bilder, die zur Rekonstruktion der Kerne in 3D verwendet wurden, wurden mit unserer Anwendung exportiert. Die vollautomatisierte 3D-Zellkerndetektionsmethode ist in der verfügbar
WingJ Matlab Toolbox
. Das 3D-Rendering des Videos wurde mit erhalten
Imaris
.
Statistische Analyse und Inferenz von Gennetzwerken
Schließlich bieten wir Forschern
Matlab-Werkzeuge
unterstützung bei der Organisation und Analyse der mit WingJ (objektorientierte Implementierung) exportierten Datensätze.
Der erste Satz von Werkzeugen ist dem gewidmet
analyse von struktur- oder phänotypischen Daten
und kann verwendet werden, um schnell statistische Tests durchzuführen und Daten zu zeichnen (Abb. 1a). Ein zweites Paket implementiert eine
netzwerk-Inferenz-Methode
um Vorhersagen über die Struktur von genregulatorischen Netzwerken unter Verwendung von Expressionskarten, dh räumlichen 2D- und möglicherweise 3D-Expressionsdaten, zu treffen (Abb. 1b).
